Virology Journal volumen 2, Número de artículo: 69 (2005) Citar este artículoEl síndrome respiratorio agudo severo (SARS) es causado por un coronavirus recientemente descubierto (SARS-CoV).Actualmente no se dispone de una terapia profiláctica o posterior a la exposición eficaz.Sin embargo, informamos que la cloroquina tiene fuertes efectos antivirales en la infección por SARS-CoV de células de primates.Estos efectos inhibidores se observan cuando las células se tratan con el fármaco antes o después de la exposición al virus, lo que sugiere una ventaja tanto profiláctica como terapéutica.Además de las funciones bien conocidas de la cloroquina, como las elevaciones del pH endosomal, el fármaco parece interferir con la glicosilación terminal del receptor celular, la enzima convertidora de angiotensina 2. Esto puede influir negativamente en la unión del virus al receptor y anular la infección. con ramificaciones adicionales por la elevación del pH vesicular, lo que da como resultado la inhibición de la infección y la propagación del SARS CoV en concentraciones clínicamente admisibles.La cloroquina es eficaz para prevenir la propagación del SARS CoV en cultivos celulares.Se observó una inhibición favorable de la propagación del virus cuando las células se trataron con cloroquina antes o después de la infección por SARS CoV.Además, el ensayo de inmunofluorescencia indirecta descrito en este documento representa un método simple y rápido para detectar compuestos antivirales contra el SARS-CoV.El síndrome respiratorio agudo severo (SARS, por sus siglas en inglés) es una enfermedad emergente que se notificó por primera vez en la provincia de Guangdong, China, a fines de 2002. La enfermedad se propagó rápidamente a por lo menos 30 países a los pocos meses de su aparición, y los esfuerzos concertados en todo el mundo llevaron a la identificación de el agente etiológico como coronavirus SARS (SARS-CoV), un nuevo miembro de la familia Coronaviridae [1].La secuenciación completa del genoma del SARS-CoV [2, 3] confirmó que este patógeno no está estrechamente relacionado con ninguno de los grupos de coronavirus previamente establecidos.La gemación del SARS-CoV ocurre en el aparato de Golgi [4] y da como resultado la incorporación de la glicoproteína de pico de la envoltura en el virión.La glicoproteína espiga es una proteína de membrana de tipo I que facilita la unión viral al receptor celular y el inicio de la infección, y la enzima convertidora de angiotensina-2 (ACE2) se ha identificado como un receptor celular funcional del SARS-CoV [5].Recientemente hemos demostrado que el procesamiento de la proteína espiga se efectuó mediante convertasas similares a furina y que la inhibición de esta escisión por un inhibidor específico anuló la citopaticidad y redujo significativamente el título del virus del SARS-CoV [6].Debido a la gravedad de la infección por SARS-CoV, la posibilidad de que la enfermedad se propague rápidamente y la ausencia de inhibidores del virus in vivo comprobados como eficaces y seguros, es importante identificar medicamentos que puedan usarse de manera efectiva para tratar o prevenir posibles infecciones. Infecciones por SARS-CoV.Se han evaluado muchos enfoques terapéuticos novedosos en estudios de laboratorio de SARS-CoV: entre estos enfoques se destacan aquellos que usan siRNA [7], transferencia pasiva de anticuerpos [8], vacunación con ADN [9], virus vaccinia o parainfluenza que expresa la proteína de pico [10 , 11], interferones [12, 13] y anticuerpos monoclonales contra la subunidad S1 de la glicoproteína espiga que bloquea la unión al receptor [14].En este informe, describimos la identificación de la cloroquina como un agente antiviral efectivo antes y después de la infección por SARS-CoV.La cloroquina, una 9-aminoquinolina que se identificó en 1934, es una base débil que aumenta el pH de las vesículas ácidas.Cuando se agrega extracelularmente, la porción no protonada de cloroquina ingresa a la célula, donde se protona y concentra en orgánulos ácidos de pH bajo, como endosomas, vesículas de Golgi y lisosomas.La cloroquina puede afectar la infección por el virus de muchas maneras, y el efecto antiviral depende en parte de la medida en que el virus utiliza los endosomas para entrar.La cloroquina se ha utilizado ampliamente para tratar enfermedades humanas, como la malaria, la amebiosis, el VIH y las enfermedades autoinmunes, sin efectos secundarios perjudiciales significativos [15].Junto con los datos presentados aquí, que muestran la inhibición del virus en cultivos celulares por dosis de cloroquina compatibles con el tratamiento del paciente, estas características sugieren que se justificaría una mayor evaluación de la cloroquina en modelos animales de infección por SARS-CoV a medida que avanzamos hacia la búsqueda de antivirales efectivos para la prevención o el tratamiento. de la enfermedadPara investigar si la cloroquina podría prevenir la infección por SARS-CoV, se pretrataron células Vero E6 permisivas [1] con varias concentraciones de cloroquina (0,1–10 μM) durante 20–24 h antes de la infección por el virus.Luego, las células se infectaron con SARS-CoV y los antígenos del virus se visualizaron mediante inmunofluorescencia indirecta como se describe en Materiales y métodos.El examen microscópico (Fig. 1A) de las células de control (sin tratar, infectadas) reveló una extensa inmunotinción específica del SARS-CoV de la monocapa.Se observó una disminución dependiente de la dosis en las células positivas para el antígeno del virus a partir de cloroquina 0,1 μM, y concentraciones de 10 μM eliminaron por completo la infección por SARS-CoV.Con fines cuantitativos, contamos el número de células teñidas positivas de tres ubicaciones aleatorias en un portaobjetos.El número promedio de células de control teñidas positivamente se calificó como 100 % y se comparó con el número de células positivas observadas bajo diversas concentraciones de cloroquina (Fig. 1B).El pretratamiento con cloroquina 0,1, 1 y 10 μM redujo la infectividad en un 28 %, 53 % y 100 %, respectivamente.Se obtuvieron resultados reproducibles de tres experimentos independientes.Estos datos demostraron que el pretratamiento de las células Vero E6 con cloroquina hizo que estas células fueran refractarias a la infección por SARS-CoV.Efecto profiláctico de la cloroquina.Células Vero E6 pretratadas con cloroquina durante 20 horas.Se retiraron los medios que contenían cloroquina y las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato antes de que se infectaran con SARS-CoV (0,5 multiplicidad de infección) durante 1 h.en ausencia de cloroquina.Luego se eliminó el virus y las células se mantuvieron en Opti-MEM (Invitrogen) durante 16 a 18 h en ausencia de cloroquina.Los antígenos del SARS-CoV se tiñeron con HMAF específico del virus, seguido de anticuerpos secundarios conjugados con FITC.(A) La concentración de cloroquina utilizada se indica en la parte superior de cada panel.(B) Se capturaron células positivas para el antígeno del SARS-CoV en tres ubicaciones aleatorias mediante el uso de una cámara digital, se determinó el número de células positivas para el antígeno y se calculó la inhibición promedio.El porcentaje de inhibición se obtuvo considerando el control no tratado como 0% de inhibición.Las barras verticales representan el rango de SEM.Para investigar las propiedades antivirales de la cloroquina en el SARS-CoV después del inicio de la infección, las células Vero E6 se infectaron con el virus y se agregó medio fresco suplementado con varias concentraciones de cloroquina inmediatamente después de la adsorción del virus.Las células infectadas se incubaron durante 16 a 18 h adicionales, después de lo cual se analizó la presencia de antígenos virales mediante análisis de inmunofluorescencia indirecta.Cuando se agregó cloroquina después del inicio de la infección, hubo una disminución dramática, dependiente de la dosis, en el número de células positivas al antígeno del virus (Fig. 2A).Tan solo 0,1–1 μM de cloroquina redujo la infección en un 50 % y se observó una inhibición de hasta 90–94 % con concentraciones de 33–100 μM (Fig. 2B).A concentraciones de cloroquina superiores a 1 μM, solo se infectó inicialmente un pequeño número de células individuales, y la propagación de la infección a las células adyacentes casi se eliminó.Se estimó que se producía un efecto inhibitorio medio máximo con 4,4 ± 1,0 μM de cloroquina (Fig. 2C).Estos datos muestran claramente que la adición de cloroquina puede reducir eficazmente el establecimiento de la infección y la propagación del SARS-CoV si el fármaco se añade inmediatamente después de la adsorción del virus.El tratamiento con cloroquina posterior a la infección reduce la infección y la propagación del SARS-CoV.Las células Vero E6 se sembraron e infectaron como se describe en la Fig. 1, excepto que la cloroquina se añadió solo después de la adsorción del virus.Las células se mantuvieron en Opti-MEM (Invitrogen) que contenía cloroquina durante 16 a 18 h, después de lo cual se procesaron para inmunofluorescencia.(A) La concentración de cloroquina se indica en la parte superior.(B) El porcentaje de inhibición y SEM se calcularon como en la Fig. 1B.(C) La dosis efectiva (ED50) se calculó usando un software comercialmente disponible (Grafit, versión 4, Erithacus Software).El análisis microscópico electrónico indicó la aparición de cantidades significativas de partículas virales extracelulares 5-6 h después de la infección [16].Dado que observamos los efectos antivirales de la cloroquina inmediatamente después de la adsorción del virus, ampliamos aún más el análisis agregando cloroquina 3 y 5 h después de la adsorción del virus y examinamos la presencia de antígenos del virus después de 20 h.Descubrimos que la cloroquina seguía siendo significativamente eficaz incluso cuando se añadía 5 h después de la infección (Fig. 3);sin embargo, para obtener un efecto antiviral equivalente, se requería una mayor concentración de cloroquina si el fármaco se añadía 3 o 5 h después de la adsorción.Tratamiento posinfeccioso cronometrado con cloroquina.Este experimento es similar al representado en la Fig. 2, excepto que las células se infectaron con 1 multiplicidad de infección y se añadió cloroquina (10, 25 y 50 μM) 3 o 5 h después de la infección.Dado que la cloroquina inhibió la infección por SARS-CoV cuando se agregó antes o después de la infección, planteamos la hipótesis de que otro agente lisosomotrópico común, NH4Cl, también podría funcionar de manera similar.El cloruro de amonio se ha utilizado ampliamente en estudios que abordan la entrada de virus mediada por endosomas.Coincidentemente, recientemente se demostró que NH4Cl reduce la transducción de pseudotipos de virus decorados con la proteína de punta del SARS-CoV [17, 18].En un intento por examinar si el NH4Cl funciona de manera similar a la cloroquina, realizamos análisis de infección en células Vero E6 antes (Fig. 4A) y después (Fig. 4B) de que fueran tratadas con varias concentraciones de NH4Cl.En ambos casos, observamos una inhibición del 93-99 % con NH4Cl a ≥ 5 mM.Estos datos indicaron que el NH4Cl (≥ 5 mM) y la cloroquina (≥ 10 μM) son muy efectivos para reducir la infección por SARS-CoV.Estos resultados sugieren que los efectos de la cloroquina y el NH4Cl en el control de la infección y propagación del SARS CoV podrían estar mediados por mecanismos similares.NH 4 Cl inhibe el SARS-CoV durante el tratamiento previo o posterior a la infección.Se añadió NH4Cl a las células antes (A) o después (B) de la infección, de forma similar a lo que se hizo con la cloroquina en las Figs. 1 y 2. Se contaron las células con antígeno positivo y los resultados se presentaron como en la Fig. 1B.Realizamos experimentos adicionales para dilucidar el mecanismo de inhibición del SARS-CoV por la cloroquina y el NH4Cl.Dado que el pH ácido intravesicular regula las funciones celulares, incluido el recorte de N-glicosilación, el tráfico celular y diversas actividades enzimáticas, fue de interés caracterizar el efecto de ambos fármacos en el procesamiento, la glicosilación y la clasificación celular de la glicoproteína espiga del SARS-CoV. y su receptor, ACE2.El análisis de citometría de flujo se realizó en células Vero E6 que no se trataron o se trataron con concentraciones de cloroquina o NH4Cl anti-SARS-CoV altamente efectivas.Los resultados revelaron que ninguno de los fármacos causó un cambio significativo en los niveles de ACE2 en la superficie celular, lo que indica que los efectos inhibidores observados en la infección por SARS-CoV no se deben a la falta de ACE2 en la superficie celular disponible (Fig. 5A).A continuación, analizamos las formas moleculares de la ACE2 endógena en células Vero E6 no tratadas y en células que se preincubaron durante 1 h con varias concentraciones de NH4Cl (2,5–10 mM) o cloroquina (1 y 10 μM) y se marcaron con 35S- (Met) durante 3 h en presencia o ausencia de los fármacos (Fig. 5B y 5C).En condiciones normales, observamos dos formas inmunorreactivas de ACE2, que migraban a ~105 y ~113 kDa, respectivamente (Fig. 5B, carril 1).La proteína de ~105 kDa es sensible a la endoglicosidasa H, lo que sugiere que representa la forma localizada del retículo endoplásmico (RE), mientras que la proteína de ~113 kDa es resistente a la endoglicosidasa H y representa la forma modificada de Golgi de ACE2 [19].La especificidad del anticuerpo se confirmó desplazando las bandas de proteína inmunorreactiva con un exceso de ACE2 humano recombinante soluble en frío (+ rhACE2; Fig. 5B, carril 2).Cuando analizamos las formas de ACE2 en presencia de NH4Cl, se observó un claro aumento gradual en la migración de la proteína de ~113 kDa con concentraciones crecientes de NH4Cl, con un efecto máximo observado a 10 mM de NH4Cl, lo que resultó en solo la forma ER de ACE2 siendo visible en el gel (Fig. 5B, comparar carriles 3–5).Esto sugirió que el recorte y/o las modificaciones terminales de las cadenas N-glicosiladas de ACE2 se vieron afectadas por el tratamiento con NH4Cl.Además, a NH4Cl 10 mM, la forma ER de ACE2 migró con una movilidad ligeramente más rápida, lo que indica que NH4Cl a esa concentración también podría afectar la glicosilación central.También examinamos el estado de glicosilación terminal de ACE2 cuando las células se trataron con cloroquina (Fig. 5C).Similar al NH4Cl, se observó un aumento gradual en la movilidad electroforética de ACE2 con concentraciones crecientes de cloroquina.A 25 μM de cloroquina, la movilidad electroforética más rápida de la forma modificada de Golgi de ACE2 fue claramente evidente.Sobre la base de los análisis de citometría de flujo y de inmunoprecipitación, se puede inferir que tanto el NH4Cl como la cloroquina afectaron la glicosilación terminal de ACE2, mientras que el NH4Cl resultó en un efecto más dramático.Aunque ACE2 se expresa en cantidades similares en la superficie celular, las variaciones en su estado de glicosilación podrían hacer que la interacción ACE2-SARS-CoV sea menos eficiente e inhibir la entrada del virus cuando las células se tratan con NH4Cl y cloroquina.Efecto de los agentes lisomotrópicos sobre la expresión de la superficie celular y la biosíntesis de ACE2.(A) Las células Vero E6 se cultivaron durante 20 h en ausencia (control) o presencia de cloroquina (10 μM) o NH4Cl (20 mM).Las células se marcaron con anti-ACE2 (histograma gris) o con un anticuerpo secundario solo (histograma blanco).(B) Biosíntesis de ACE2 en células no tratadas o en células tratadas con NH4Cl.Las células Vero E6 se marcaron mediante pulsos durante 3 h con 35S-Met y los lisados ​​celulares se inmunoprecipitaron con un anticuerpo ACE2 (carril 1).La incubación previa del anticuerpo con ACE2 humano recombinante (rhACE2) eliminó completamente la señal (carril 2).Se enfatizan las posiciones de la forma ER sensible a la endoglicosidasa H y la forma de Golgi de ACE2 resistente a la endoglicosidasa H.Tenga en cuenta que el aumento de la concentración de NH4Cl resulta en la disminución de la forma de Golgi de ACE2.(C) Se realizó un experimento similar en presencia de las concentraciones indicadas de cloroquina.Tenga en cuenta la pérdida de glicanos terminales con concentraciones crecientes de cloroquina.(D) La modificación glucosídica terminal de ACE2 se evaluó mediante tratamiento con neuraminidasa de ACE2 inmunoprecipitado.Aquí, las células se trataron con concentraciones de cloroquina de 1 a 25 μM durante la inanición, el pulso y la persecución de 3 h.Para confirmar que ACE2 sufre modificaciones terminales de azúcar y que la glicosilación terminal se ve afectada por el tratamiento con NH4Cl o cloroquina, realizamos inmunopreipitación de ACE2 marcada con 35S y sometimos los inmunoprecipitados a digestión con neuraminidasa.Las proteínas se resolvieron usando SDS-PAGE (Fig. 5D).Es evidente a partir de la movilidad ligeramente más rápida de la forma de Golgi de ACE2 después del tratamiento con neuraminidasa (Fig. 5D, comparar carriles 1 y 2), que ACE2 experimenta glicosilación terminal;sin embargo, la forma ER de ACE2 no se vio afectada por la neuraminidasa.Las células tratadas con cloroquina 10 μM no dieron como resultado un cambio significativo;mientras que la cloroquina 25 μM hizo que la forma de Golgi de ACE2 se resolviera de manera similar a la ACE2 tratada con neuraminidasa (Fig. 5D, comparar carriles 5 y 6).Estos datos proporcionan evidencia de que ACE2 sufre una glicosilación terminal y que la cloroquina en concentraciones anti-SARS-CoV anula el proceso.A continuación, abordamos si los fármacos lisosomotrópicos (NH4Cl y cloroquina) afectan la biosíntesis, la glicosilación y/o el tráfico de la glicoproteína espiga del SARS-CoV.Para ello, se infectaron células Vero E6 con SARS-CoV durante 18 h.Se añadió cloroquina o cloruro de amonio a estas células mientras se les privaba de alimento (1 h), se marcaban (30 min) o se perseguían (3 h).Los lisados ​​​​celulares se analizaron mediante inmunoprecipitación con el anticuerpo policlonal específico del SARS (HMAF).Los resultados del pulso de 30 minutos indicaron que pro-spike (proS) se sintetizó como un precursor de ~ 190 kDa (proS-ER) y se procesó en proteínas de ~ 125, ~ 105 y ~ 80 kDa (Fig. 6A, carril 2), resultado idéntico al de nuestro análisis anterior [6].Excepto por la cloroquina 100 μM (Fig. 6A, carril 3), no hubo diferencias significativas en la biosíntesis o el procesamiento de la proteína del pico del virus en células no tratadas o tratadas con cloroquina (Fig. 6A, carriles 4–6).Cabe señalar que la cloroquina a 100 μM resultó en una disminución general de la biosíntesis y de los niveles de glicoproteína viral procesada.En vista de la falta de reducción en la biosíntesis y el procesamiento de la glicoproteína espiga en presencia de concentraciones de cloroquina (10 y 50 μM) que causaron grandes reducciones en la replicación y propagación del SARS-CoV, concluimos que el efecto antiviral probablemente no se deba a la alteración de la biosíntesis y procesamiento de glicoproteínas virales.Se realizaron análisis similares con NH4Cl, y los datos sugirieron que la biosíntesis y el procesamiento de la proteína de pico tampoco se vieron afectados negativamente por NH4Cl (Fig. 6A, carriles 7-12).De acuerdo con nuestro análisis anterior [6], observamos la presencia de una proteína más grande, que aquí se denomina oligómeros.Recientemente, Song et al.[20] proporcionaron evidencia de que estos son homotrímeros de la proteína de punta del SARS-CoV y se incorporaron a los viriones.Curiosamente, los niveles de los homotrímeros en las células tratadas con cloroquina 100 μM y NH4Cl 40 y 20 mM (Fig. 6A, carriles 3, 9 y 10) fueron ligeramente más bajos que en las células de control o las células tratadas con concentraciones más bajas de fármaco.Efectos del NH 4 Cl y la cloroquina (CQ) en la biosíntesis, el procesamiento y la glicosilación de la proteína espiga del SARS-CoV.Las células Vero E6 se infectaron con SARS-CoV como se describe en la Fig. 2. Se agregó CQ o NH4Cl durante los períodos de inanición (1 h) y etiquetado (30 min) con 35S-Cys y seguido de persecución durante 3 h en presencia de medio sin etiquetar.Las células se lisaron en tampón RIPA y se inmunoprecipitaron con HMAF.Las proteínas del virus se resolvieron utilizando gel NuPAGE al 3-8% (Invitrogen).Las células presentadas se marcaron durante 30 min (A) y se persiguieron durante 3 h (B).Las posiciones de migración de las diversas formas moleculares de pico se indican en el lado derecho y las de los estándares moleculares se muestran en el lado izquierdo.proS-ER y proS-Golgi son el pro-spike de SARS-Co en los compartimentos ER y Golgi, respectivamente, y proS-ungly es el pro-spike ER no glicosilado.Los datos obtenidos de un pulso de 30 minutos seguido de una persecución de 3 horas (Fig. 6B, carriles 2 y 8) confirmaron nuestra observación anterior de que el precursor de la proteína del pico del SARS-CoV (proS-ER) adquiere modificaciones específicas de Golgi (proS -Golgi) dando como resultado una proteína de ~210 kDa [6].La cloroquina a 10, 25 y 50 μM no tuvo un impacto negativo sustancial en la apariencia de la forma de Golgi (Fig. 6B, compare el carril 2 con los carriles 4–6).Sólo a 100 µM de cloroquina se observó una reducción en el nivel de la propunta modificada de Golgi (carril 3).Por otro lado, NH4Cl anuló la aparición de formas modificadas de Golgi a ≥10 mM (comparar carril 8 con 9-11) y tuvo un efecto más leve a 1 mM (carril 12).Estos datos demuestran claramente que la biosíntesis y el procesamiento proteolítico de la proteína espiga del SARS-CoV no se ven afectados por las dosis de cloroquina (25 y 50 μM) y NH4Cl (1 mM) que causan efectos inhibidores del virus.Además, con NH4Cl 40, 20 y 10 mM, hubo una mayor acumulación de proS-ER con una disminución concomitante en la cantidad de oligómeros (Fig. 6B, carriles 9-11).Cuando examinamos los homotrímeros, encontramos que la cloroquina a 100 μM y el NH4Cl a 40 y 20 mM dieron como resultado una movilidad ligeramente más rápida de los trímeros (Fig. 6B, carriles 3, 9 y 10), pero dosis más bajas del fármaco, que sí exhibieron efectos antivirales significativos, no resultó en diferencias apreciables.Estos datos sugieren que la proteína espiga intracelular recién sintetizada puede no ser un objetivo importante para la acción antiviral de la cloroquina y el NH4Cl.La movilidad más rápida del trímero a ciertas concentraciones más altas de los fármacos podría deberse al efecto de estos fármacos sobre la glicosilación terminal de los trímeros.Hemos identificado la cloroquina como un agente antiviral eficaz para el SARS-CoV en condiciones de cultivo celular, como lo demuestra su efecto inhibidor cuando se agrega el fármaco antes de la infección o después del inicio y establecimiento de la infección.El hecho de que la cloroquina ejerza un efecto antiviral durante las condiciones previas y posteriores a la infección sugiere que es probable que tenga ventajas tanto profilácticas como terapéuticas.Recientemente, Keyaerts et al.[21] informaron las propiedades antivirales de la cloroquina e identificaron que el fármaco afecta la replicación del SARS-CoV en cultivos celulares, como lo demuestra la RT-PCR cuantitativa.Tomado junto con los hallazgos de Keyaerts et al.[21], nuestro análisis proporciona más pruebas de que la cloroquina es eficaz contra las cepas Frankfurt y Urbani del SARS-CoV.Hemos proporcionado evidencia de que la cloroquina es efectiva para prevenir la infección por SARS-CoV en cultivos celulares si el medicamento se agrega a las células 24 h antes de la infección.Además, la cloroquina fue significativamente eficaz incluso cuando el fármaco se añadió de 3 a 5 horas después de la infección, lo que sugiere un efecto antiviral incluso después del establecimiento de la infección.Dado que se obtuvieron resultados similares mediante el tratamiento con NH4Cl de las células Vero E6, los mecanismos de acción subyacentes de estos fármacos podrían ser similares.Aparte del papel probable de la cloroquina en la replicación del SARS-CoV, los mecanismos de acción de la cloroquina en el SARS-CoV no se comprenden completamente.Estudios previos han sugerido la elevación del pH como un mecanismo por el cual la cloroquina reduce la transducción de virus pseudotipo SARS-CoV [17, 18].Examinamos el efecto de la cloroquina y el NH4Cl en las proteínas de punta del SARS-CoV y en su receptor, ACE2.Los resultados de inmunoprecipitación de ACE2 demostraron claramente que las concentraciones efectivas de cloroquina y NH4Cl anti-SARS-CoV también afectaron la glicosilación terminal de ACE2.Sin embargo, los datos de citometría de flujo demostraron que no hay diferencias significativas en la expresión de ACE2 en la superficie celular en células tratadas con cloroquina o NH4Cl.Sobre la base de estos resultados, es razonable sugerir que el pretratamiento con NH4Cl o cloroquina posiblemente haya resultado en la expresión superficial de la ACE2 subglucosilada.En el caso del tratamiento con cloroquina antes de la infección, el deterioro de la glicosilación terminal de ACE2 puede dar como resultado una reducción de las afinidades de unión entre ACE2 y la proteína espiga del SARS-CoV e influir negativamente en el inicio de la infección por SARS-CoV.Dado que la biosíntesis, el procesamiento, la modificación de Golgi y la oligomerización de la proteína espiga recién sintetizada no se vieron afectados de manera apreciable por las concentraciones anti-SARS-CoV de cloroquina o NH4Cl, concluimos que estos eventos ocurren en la célula independientemente de la presencia de los medicamentos. .No se puede descartar la potencial contribución de estos fármacos en la elevación del pH endosomal y su impacto en la posterior entrada o salida del virus.Se observó una disminución en la transducción del pseudotipo SARS-CoV en presencia de NH4Cl y se atribuyó al efecto sobre el pH intracelular [17, 18].Cuando se agrega cloroquina o NH4Cl después de la infección, estos agentes pueden elevar rápidamente el pH y subvertir los eventos de fusión en curso entre el virus y los endosomas, inhibiendo así la infección.Además, el mecanismo de acción del NH4Cl y la cloroquina podría depender de cuándo se agregaron a las células.Cuando se agregan después del inicio de la infección, estos medicamentos pueden afectar la fusión mediada por endosomas, la posterior replicación del virus o el ensamblaje y la liberación.Estudios previos de cloroquina han demostrado que tiene múltiples efectos sobre las células de mamíferos además de la elevación del pH endosomal, incluida la prevención de la glicosilación terminal de inmunoglobulinas [22].Cuando se agrega a las células infectadas por el virus, la cloroquina inhibe las etapas posteriores de la maduración del virus de la estomatitis vesicular al inhibir la expresión de la glicoproteína en la superficie celular [23], e inhibe la producción de partículas infecciosas de VIH-1 al interferir con la glicosilación terminal de la glicoproteína [23]. 24, 25].Sobre la base de estas propiedades, sugerimos que la expresión en la superficie celular de ACE2 subglucosilada y su escasa afinidad con la proteína de punta del SARS-CoV pueden ser el mecanismo principal por el cual se previene la infección mediante el tratamiento previo con fármacos de las células antes de la infección.Por otro lado, la elevación rápida del pH endosomal y la anulación de la fusión virus-endosoma pueden ser el mecanismo principal por el cual se previene la infección viral en las condiciones posteriores al tratamiento.Se realizarán ensayos de unión más detallados de SARS CoV spike-ACE2 en presencia o ausencia de cloroquina para confirmar nuestros hallazgos.Nuestros estudios indican que el impacto del NH4Cl y la cloroquina en los perfiles de proteína ACE2 y pico son significativamente diferentes.NH4Cl exhibe un efecto más pronunciado que la cloroquina en la glicosilación terminal, lo que destaca las nuevas e intrincadas diferencias entre la cloroquina y el cloruro de amonio al afectar el transporte de proteínas o la glicosilación de la proteína espiga del SARS-CoV y su receptor, ACE2, a pesar de sus efectos similares bien establecidos de elevación del pH endosomal.La infectividad de los coronavirus distintos del SARS-CoV también se ve afectada por la cloroquina, como lo demuestra el CoV-229E humano [15].Los efectos inhibitorios observados sobre la infectividad del SARS-CoV y la propagación celular ocurrieron en presencia de cloroquina de 1 a 10 μM, que son concentraciones plasmáticas alcanzables durante la profilaxis y el tratamiento de la malaria (que varían de 1,6 a 12,5 μM) [26] y, por lo tanto, están bien tolerado por los pacientes.Recientemente se especuló que la cloroquina podría ser eficaz contra el SARS y los autores sugirieron que este compuesto podría bloquear la producción de TNFα, IL6 o IFNγ [15].Nuestros datos proporcionan evidencia de la posibilidad de utilizar el fármaco bien establecido cloroquina en el tratamiento clínico del SARS.La cloroquina, un fármaco relativamente seguro, eficaz y económico que se utiliza para tratar muchas enfermedades humanas, como la malaria, la amebiosis y el virus de la inmunodeficiencia humana, es eficaz para inhibir la infección y la propagación del SARS CoV en cultivos celulares.El hecho de que el fármaco tenga un efecto antiviral inhibitorio significativo cuando las células susceptibles fueron tratadas antes o después de la infección sugiere un posible uso profiláctico y terapéutico.Se infectaron células Vero E6 (una línea celular de riñón de mono verde africano) con SARS-CoV (cepa Urbani) a una multiplicidad de infección de 0,5 durante 1 h.Las células se lavaron con PBS y luego se incubaron en medio OPTI-MEM (Invitrogen) con o sin varias concentraciones de cloroquina o NH4Cl (ambos de Sigma).La tinción de inmunofluorescencia se realizó con líquido ascítico de ratón hiperinmune específico del SARS-CoV (HMAF) [8] seguido de anticuerpo acoplado con fluoresceína anti-ratón.Dieciocho horas después de la infección, se eliminaron los sobrenadantes que contenían virus y las células se sometieron a pulsos con 35S-(Cys) durante 30 min y se siguieron durante 3 h antes de la lisis en tampón RIPA.Los medios y lisados ​​celulares clarificados se incubaron con HMAF, y las proteínas inmunoprecipitadas se separaron con gel NuPAGE al 3-8 % (Invitrogen);las proteínas se visualizaron por autorradiografía.En algunos experimentos, las células se persiguieron durante 3 h con medio libre de isótopos.Los sobrenadantes de células clarificadas también se inmunoprecipitaron con HMAF específico para SARS-CoV.Se sembraron células Vero E6 en medio Eagle modificado de Dulbecco (Invitrogen) complementado con suero bovino fetal al 10%.Al día siguiente, las células se incubaron en Opti-MEM (Invitrogen) en presencia o ausencia de cloroquina 10 μM o NH4Cl 20 mM.Para analizar los niveles de ACE2 en la superficie celular, las células se incubaron en hielo con 10 μg/mL de anticuerpo anti-ACE2 de cabra purificado por afinidad (R&D Systems) y luego se incubaron con anticuerpo IgG anti-cabra porcino marcado con FITC (Caltag Laboratories) .Las células marcadas se analizaron mediante citometría de flujo con un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences).Para los estudios de biosíntesis de ACE2, las células Vero E6 se pulsaron con 250 μCi de 35S-(Met) (Perkin Elmer) durante 3 h con las concentraciones indicadas de cloroquina o NH4Cl y luego se lisaron en tampón RIPA.Los lisados ​​clarificados se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-ACE2 de cabra purificado por afinidad (R&D Systems), y las proteínas inmunoprecipitadas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS.Ksiazek TG, Erdman D, Goldsmith CS, Zaki SR, Peret T, Emery S, Tong S, Urbani C, Comer JA, Lim W, Rollin PE, Dowell SF, Ling AE, Humphrey CD, Shieh WJ, Guarner J, Paddock CD , Rota PB, Fields B, DeRisi J, Yang JY, Cox N, Hughes J, LeDuc JW, Bellini WJ, Anderson LJ, SARS Working Group: Un nuevo coronavirus asociado con el síndrome respiratorio agudo severo.N Engl J Med 2003, 348: 1953-1966.10.1056/NEJMoa030781Artículo de CAS PubMed Google AcadémicoMarra MA, Jones SJ, Astell CR, Holt RA, Brooks-Wilson A, Butterfield YS, Khattra J, Asano JK, Barber SA, Chan SY, Cloutier A, Coughlin SM, Freeman D, Girn N, Griffith OL, Leach SR, Mayo, McDonald H, Montgomery SB, Pandoh PK, Petrescu AS, Robertson AG, Schein JE, Siddiqui A, Smailus DE, Stott JM, Yang GS, Plummer F, Andonov A, Artsob H, Bastien N, Bernard K, Booth TF, Bowness D, Czub M, Drebot M, Fernando L, Flick R, Garbutt M, Gray M, Grolla A, Jones S, Feldmann H, Meyers A, Kabani A, Li Y, Normand S, Stroher U, Tipples GA, Tyler S , Vogrig R, Ward D, Watson B, Brunham RC, Krajden M, Petric M, Skowronski DM, Upton C, Roper RL: La secuencia del genoma del coronavirus asociado al SARS.Ciencia 2003, 300: 1399-1404.10.1126/ciencia.1085953Artículo de CAS PubMed Google AcadémicoRota PA, Oberste MS, Monroe SS, Nix WA, Campagnoli R, Icenogle JP, Penaranda S, Bankamp B, Maher K, Chen MH, Tong S, Tamin A, Lowe L, Frace M, DeRisi JL, Chen Q, Wang D , Erdman DD, Peret TC, Burns C, Ksiazek TG, Rollin PE, Sanchez A, Liffick S, Holloway B, Limor J, McCaustland K, Olsen Rasmussen M, Fouchier R, Gunther S, Osterhaus AS, Drosten C, Pallansch MA, Anderson LJ, Bellini WJ: Caracterización de un nuevo coronavirus asociado con el síndrome respiratorio agudo severo.Ciencia 2003, 300: 1394-1399.10.1126/ciencia.1085952Artículo de CAS PubMed Google AcadémicoNg ML, Tan SH, Ver EE, Ooi EE, Ling AE: Crecimiento proliferativo del coronavirus del SARS en células Vero E6.J Gen Virol 2003, 84: 3291-3303.10.1099/vir.0.19505-0Artículo de CAS PubMed Google AcadémicoLos autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.A continuación se encuentran los enlaces a los archivos originales enviados por los autores para las imágenes.Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt© 2022 BioMed Central Ltd a menos que se indique lo contrario.